生物化学与分子生物学是在分子水平上研究生命的科学，是人类探索生命的知识结晶和有力武器。生物化学与分子生物学的完整体系不仅包括其理论体系，还包括其技术体系。该学科的快速发展在很大程度上得益于一系列实验技术的创新和仪器设备的发明，如 DNA重组技术、核酸分子杂交技术、 PCR技术、转基因技术、基因打靶技术、 DNA芯片技术、基因测序技术、蛋白质组学技术等，这些技术本身构成了生物化学与分子生物学的重要内容。生物化学与分子生物学实验技术以生物分子为研究对象，通过各种手段对其理化性质、组成结构、功能活性以及在生命活动中的作用进行研究，因此也称分子实验技术（ experimental techniques of the molecular）。
分子实验技术简史
早在 19世纪 30年代，李比希（ J. von Liebig）就将定量分析技术用于生物体的研究。 20世纪 20年代，微量分析技术用于生物分子的研究，促进了维生素、激素和辅酶的发现。 30年代，福林（ J. A. Folin）和吴宪先后建立了血糖分析、蛋白质含量分析、氨基酸测定等方法，这些方法至今仍在使用。1923年，斯维贝格（ T.Svedberg）制成了世界上第一台相对离心力（ relative centrifugal force， RCF）5000g的新型离心机，他用这台离心机准确测定了血红蛋白等复杂蛋白质的分子量，开启了用离心机分离生物大分子的先河，为此，他获得了 1926年的诺贝尔化学奖。为了纪念这位超离心技术的奠基人，人们将大分子沉降系数（ sedimentation coef.cient，S）的基数（ 10.13 s）命名为 1个 Svedberg单位（ 1S＝110.13 s）。1809年，列依斯（ Peйce）首次发现电泳现象。 1909年，米凯利斯（ L. Michaelis）首次将胶体颗粒在电场中的移动现象称为电泳（ electrophoresis）。1937年，提塞留斯（ A. W. K. Tiselius）对电泳仪器做了改进，制成提塞留斯电泳仪，建立了研究蛋白质的移动界面电泳方法，并首次证明血清蛋白包括白蛋白及 、、球蛋白。由于在电泳技术方面做出的开拓性贡献，提塞留斯获得了 1948年的诺贝尔化学奖。 1948年，维兰德（ H. Wieland）和费舍尔（ H. Fischer）发展了以
滤纸作为支持介质的电泳方法，对氨基酸进行分离。 1949年，鲍林（ L. C. Pauling）等用电泳法证明镰形红细胞贫血是因为有异常血红蛋白的存在，据此引入分子病（ molecular disease）的概念。1950年，杜若姆（ E. L. Durrum）用纸电泳（ paper electrophoresis）进行各种蛋白质的分离，开创了利用各种固体物质（如滤纸、醋酸纤维素薄膜、琼脂凝胶、淀粉凝胶等）作为支持介质的区带电泳方法。 1959年，雷蒙德（ S. Raymond）和温特劳布（ L. Weintraub）利用人工合成的凝胶作为支持介质，创建了聚丙烯酰胺凝胶电泳方法，极大提高了电泳的分辨率，开创了电泳技术的新时代。至今聚丙烯酰胺凝胶电泳仍是对蛋白质、多肽、核酸等生物大分子使用最普遍、分辨率最高的分析鉴定技术，是检验生化物质纯度的标准分析鉴定方法，被看作是对生物大分子进行分析鉴定最准确也是最后的手段（ last check）。1969年，韦伯（ K. Weber）应用 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测定了蛋白质的分子量。 1981年，乔根森（ J. W. Jorgenson）和卢卡奇（ K. D. Lukacs）首先在 75 m内径毛细管柱内用高电压进行电泳，建立了高效毛细管电泳（ high performance capillaryelectrophoresis，HPCE）技术。 1984年，寺部清毅（ S. Terabe）等建立了胶束毛细管电动力学色谱方法。 1987年，赫尔特（ S. Hjerten）建立了毛细管等电聚焦电泳（ capillary isoelectric focusing，CIEF），寇恩（ A. Cohen）和卡尔格（ B. Karger）建立了毛细管凝胶电泳。 1988年出现了第一批毛细管电泳仪器。由于 HPCE高效、快速、经济，适用于多肽、蛋白质（包括酶和抗体）、核苷酸以及 DNA的分离分析，短短几年内得到了迅速发展。 HPCE是经典电泳技术和现代微柱分离技术相结合的产物，是一种可以自动化操作的高效分离技术。1961年，霍尔（ B. D. Hall）和施皮格尔曼（ S. Spiegelman）建立 DNA-RNA分子杂交法。分子杂交技术与电泳技术相结合，形成了新的实验技术印迹（ blotting）技术。 1975年，萨瑟恩（ E. M. Southern）利用凝胶电泳分离 DNA片段，然后将 DNA片段转移到硝酸纤维素膜上，利用 DNA-RNA杂交检测特定的 DNA片段，创立 Southern印迹法。尔后人们用类似的方法，对 RNA和蛋白质进行印迹分析，对 RNA的印迹分析称为 Northern印迹法，对单向电泳后的蛋白质进行印迹分析称为 Western印迹法，对双向电泳后的蛋白质进行印迹分析称为 Eastern印迹法。1935年，赫维西（ G. Hevesy）制得人工放射性磷，奠定了放射性同位素示踪技术的基础，这使他获得 1943年的诺贝尔化学奖。同年，舍恩海默（ R. Schoenheimer）和瑞顿伯格（ D.Rittenberg）将同位素示踪用于糖类及脂类物质的中间代谢的研究。 1942年，舍恩海默出版《身体成分的动态》，该书大量采用 2H、15N、18O、14C等重同位素示踪的方法追踪代谢途径，从而得出体内物质不断变化更新的动态概念。放射性同位素示踪技术在 20世纪 50年代有了很大发展，为阐明各种生物分子的代谢过程起了关键作用。1940年，马丁（ A. J. P. Martin）和辛格（ R. L. M. Synge）建立色层析法，后来又发展为纸层析及分配层析，并应用于分析氨基酸，他们因此获得 1952年的诺贝尔化学奖。 1949年，斯坦（W.H.Stein）和穆尔（ S.Moore）报告了用淀粉柱区带层析测定 -乳球蛋白的全部氨基酸组成。 40年代，层析技术有了很大发展，成为分离生物分子的关键技术； 60年代，层析技术又有了重大进展。 19681972年，安芬森（ C. B.An.nsen）建立了亲和层析（ af.nity chromatography，AC）技术，开辟了层析技术的新领域。19491950年，桑格（ F. Sanger）发展了 2, 4-二硝基氟苯法，埃德曼（ P. Edman）发展了异硫氰酸苯酯法鉴定肽链的 N-末端。 1953年，桑格研究出蛋白质序列的测定方法。 1958年，斯坦、穆尔和斯帕克曼（ D. H. Spackman）设计出氨基酸自动分析仪，加快了蛋白质的分析工作。 1967年，埃德曼和贝格（ G. Begg）建成多肽氨基酸序列分析仪。 1973年，穆尔和斯坦又设计出氨基酸序列自动测定仪，大大加快了多肽一级结构的测定。1975年，桑格建立 DNA碱基序列的分析方法并不断加以改进， 1977年完成了 -174噬菌体全部 5400个碱基序列的分析。 1976年，马克萨姆（ A. M. Mexam）和吉尔伯特（ W. Gilbert）建立了快速测定大片段 DNA序列的化学法。 1977年，桑格提出应用链终止抑制法测定 DNA序列。随后， DNA序列测定仪、 DNA合成仪等相继问世。 1985年，史密斯（ M. Smith）等报道了 DNA测序中应用荧光标记取代同位素标记的方法。桑格在大分子测序方面做出了杰出贡献，他曾经两次荣获诺贝尔化学奖， 1958年因为确定了胰岛素的分子结构获奖， 1980年又因为设计出测定 DNA核苷酸排列顺序的方法而与吉尔伯特和伯格（ P. Berg）共同获奖。
研究大分子的空间结构离不开电子显微镜技术和 X射线衍射技术。 1932年，克诺尔（ M. Knoll）和鲁斯卡（ E. Ruska）制成世界上第一台电子显微镜模型，后来鲁斯卡对模型做了改进，这就是现代电子显微镜的原型，电子显微镜打开了人类观察微观世界的窗口。 1938年，阿斯伯里（W. T. Asbury）等对核酸进行了 X射线研究；伯纳尔（ J. D. Bernal）等对糜蛋白酶进行了 X射线研究。以后，肯德鲁（ J. C. Kendrew）利用 X射线衍射技术测定了肌红蛋白的结构，佩鲁兹（ M.
F. Perutz）分析了血红蛋白的结构，他们二人因此获得 1962年的诺贝尔化学奖。同年，威尔金斯（ M. H. F. Wilkins）用 X射线衍射技术证实了 DNA的双螺旋模型，与沃森（ J. D. Watson）和
克里克（ F. H. C. Crick）分享了当年的诺贝尔生理学或医学奖。 1965年，菲利普（ D. Phillips）首次用 X射线衍射技术阐明了鸡蛋清溶菌酶的三维结构。 1969年，霍奇金（ D. M. C. Hodgkin）获得 0.28 nm分辨率的胰岛素晶体结构的分析结果。 1970年和 1974年，梁栋材等先后完成了0.25 nm和 0.18 nm分辨率的牛胰岛素分子结构的分析工作。 1980年，安德森（ C. Anderson）和麦凯（ D.B.Mckay）利用 X射线分析法测定了两种 DNA结合蛋白质的结构。 1989年，约翰逊（ J. E. Johnson）等用 0.30 nm X射线分析法测定了一种二十面体病毒中蛋白质 -RNA的相互作用。1943年，钱斯（ B. Chance）首次将灵敏的分光光度法用于酶 -底物反应相互关系的研究。 20世纪 60年代，各种仪器分析方法用于生物化学研究取得很大的发展，如高效液相色谱（ high performance liquid chromatography，HPLC）技术，红外光谱（ infrared radiation，IR）、紫外光谱（ultraviolet spectrum，UV）、圆二色等光谱技术，磁共振（ nuclear magnetic resonance，NMR）技术等。20世纪 70年代，阿伯尔（ W.Arber）、史密斯（ H. O. Smith）和内森斯（ D. Nathans）发现并纯化了限制性核酸内切酶，这为后来的重组 DNA技术奠定了基础，他们 3人因此获得 1978年的诺贝尔生理学或医学奖。 1972年，伯格把猴细胞病毒 SV40的 DNA与 噬菌体的 DNA在体外重组成功。 1973年，寇恩（ S.N.Cohen）将外源 DNA片段插入大肠杆菌质粒后产生嵌合质粒，当嵌合质粒重新导入大肠杆菌时仍具有功能，这成为外源基因导入细菌的主要方法，从此开创了基因工程（ genetic engineering）。80～90年代，基因工程技术进入辉煌发展的时期。1984年，柯勒（ G. J. F. Kohler）、米尔斯坦（ C. Milstein）和杰尼（ N. K. Jerne）由于发展了单克隆抗体技术，完善了极微量蛋白质的检测技术而获得诺贝尔生理学或医学奖。 1985年，穆利斯（ K. Mullis）等建立了聚合酶链反应（ polymerase chain reaction，PCR）技术，使一向昂贵、繁杂的分子生物学实验能够在比较简易、经济的条件下有效地开展，这是基因分析技术的重大突破，对于生物化学与分子生物学的研究具有划时代的意义。这一技术在很短的时间里风行全球，在众多学科领域被广泛采用。穆利斯因此获得 1993年的诺贝尔化学奖。
分子实验技术体系
分子实验技术是在具体研究工作中建立起来并不断得到完善。从早期个别零散的实验方法，经过不断发展，形成了完整的实验技术体系。分子实验技术按其研究目的和特点可分为四个层次：第一层次是对生物分子进行分析鉴定；第二层次是对生物分子进行人工合成；第三层次是对生物分子进行人工改造；第四层次是对生物分子进行功能研究。一、生物分子的分析鉴定不同的生物分子具有不同的理化性质，据此可以对其进行分离制备和分析鉴定，具体方法又可分 5类：①根据生物分子大小不同，可采用凝胶过滤法、超滤法、超速离心法、 SDS电泳法等。②根据生物分子荷电不同，可采用等电聚焦电泳法、离子交换层析法等。③根据生物分子吸收光谱和放射性不同，可采用分光光度法（包括紫外光、红外光、荧光）、X射线结构分析法、共振法（包括电子顺磁共振、电子自旋共振、磁共振）、放射性同位素示踪法、放射免疫分析法等。④根据生物分子疏水相互作用或氢键形成的引力不同，可采用反相高效液相层析法、分子杂交法等。⑤根据生物分子特异相互作用不同，可采用亲和层析法、免疫化学分析法等。二、生物分子的人工合成不同的生物分子具有不同的组成和结构，在搞清楚生物分子结构的前提下，可以对其进行人工合成。 1828年，乌勒（ F. Wohler）用氨及氰酸铅合成了第一个有机化合物尿素； 1953年，杜维尼奥（ V. du Vigneaud）合成了第一个多肽催产素（ oxytocin）；1965年，中国人合成了第一个蛋白质牛胰岛素； 1981年，中国人合成了第一个核酸酵母丙氨酸 tRNA。这标志着人们不仅可以合成生物小分子，也可以合成生物大分子，尤其是合成生物大分子是极富挑战性的工作。例如，合成牛胰岛素就花了 7年时间。 1963年，梅里菲尔德（ B.Merri.eld）提出固相合成法，并于 1969年人工合成了具有酶活性的牛胰核糖核酸酶。这一方法后来成为合成中等大小多肽的常用方法，在此基础上设计出多肽合成的自动装置，梅里菲尔德因此获得 1984年的诺贝尔化学奖。现在氨基酸序列分析和序列合成、核苷酸序列分析和序列合成已经实现自动化。三、生物分子的人工改造生物分子的结构与功能有着密切的关系，尤其是生物大分子的组成和结构非常复杂，是长期自然进化的产物，对其进行改造，有可能使之产生新的功能。基因工程的兴起使人们可以按照预先的设计对 DNA进行剪切拼接，将其引入细胞中进行克隆表达。基因工程是重组 DNA技术的产业化设计与应用，包括上游技术和下游技术两大部分。上游技术即重组 DNA技术，主要是基因重组、克隆和表达的设计与构建；下游技术主要是基因工程菌或细胞的大规模培养以及基因产物的分离纯化。从 20世纪 70年代开始，基因工程的发展已经有四代：第一代是经典基因工程，主要是使蛋白质或多肽基因进行高效表达。第二代是蛋白质工程（ protein engineering），主要是通过基因的定向诱变使之表达出具有特殊功能的蛋白质。第三代是代谢工程（ metabolic engineering），主要是利用基因工程技术定向改造细胞的代谢途径，以改善产物的形成和细胞的性能。第四代是基因组工程（ genome engineering），主要是进行基因组或染色体的转移，也称染色体工程（chromosome engineering）。
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