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| 內容簡介： |
《医学分子细胞生物学：研究策略与技术原理》从生物医学相关前沿领域的研究主题切入，着重介绍所涉及的分子生物学和细胞生物学的技术原理与研究策略。全书共分14章，内容涉及基因组学、基因克隆、基因的表达与调控、非编码小RNA、蛋白质组学、蛋白质结构、细胞显微成像、细胞内信号转导及组织细胞电生理学等分子和细胞生物学的核心技术。另外，我们还选择了5个重要的技术专题，包括动物基因修饰、肿瘤生物标志物筛选、分子药物靶点、干细胞及基于网络的生物信息利用，旨在帮助读者尽快掌握生物医学重要前沿领域的研究策略和技术原理，从而采用合适的方法和技术解决相关的科学问题。
《医学分子细胞生物学：研究策略与技术原理》适于作为现代生物医学相关专业研究生的实验课程教材或研究参考书，也可作为生物学、农学、医学及药学等专业高年级本科生，以及生物医药领域科研工作者的科研参考书。
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| 目錄：
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前言
第一章 基因组学
第一节 概述
一、基因组学基本概念
二、人类基因组计划
第二节 研究策略及基本原理
一、遗传或连锁图谱
二、物理或分子图谱
三、基因组测序
四、基因芯片技术
五、基因克隆策略
第三节 相关实验技术及应用举例
一、RFLP作图操作举例
二、放射性杂交文库构建
三、全自动荧光标记法测序
四、基因组测序举例
五、基因芯片的操作举例
第二章 基因克隆及表达技术
第一节 概述
第二节 基于细胞的DNA分子克隆
一、基于细胞的DNA克隆的原理和方法
二、DNA文库
三、克隆载体系统
第三节 克隆基因的表达
一、表达型克隆的原理和基本条件
二、克隆基因在原核细胞中的表达
三、克隆基因在真核细胞中的表达
四、克隆基因表达产物的检测
第三章 真核细胞基因转录起始调控研究
第一节 概述
一、顺式作用元件
二、反式作用因子
第二节 真核基因转录起始调控的研究策略
一、启动子的分析
二、转录因子的分析
第三节 真核基因转录起始调控的相关技术原理
一、启动子序列的克隆
二、启动子及转录因子的鉴定
第四节 应用与实例
第四章 非编码小RNA
第一节 非编码小RNA概述
一、RNAi概述
二、microRNA概述
三、miRNA和siRNA的比较
第二节 非编码小RNA的研究策略
一、RNAi的研究策略
二、miRNA的研究策略
三、总结
第三节 非编码小RNA应用领域及其技术原理
一、RNAi技术的应用及其原理
二、miRNA的作用及其原理
第五章 蛋白质组学
第一节 概述
一、蛋白质组学的概念及其发展史
二、蛋白质组学的特点
三、蛋白质组学的研究方法和发展趋势
第二节 研究策略
一、定量蛋白质组学
二、蛋白质组翻译后修饰研究策略
三、蛋白质的相互作用研究策略
四、亚蛋白质组学研究策略
第三节 技术原理
一、蛋白质样品制备技术
二、蛋白质样品分离技术
三、蛋白质样品鉴定技术——质谱技术
四、蛋白质组生物信息学
第六章 生物大分子结构研究技术
第一节 概述
第二节 研究策略、技术原理和应用
一、X射线晶体衍射分析
二、核磁共振技术
三、电镜及电镜图像的三维重构
四、生物大分子的三维结构数据库及三维结构预测、模拟和分析
第三节 应用举例
第七章 细胞成像
第一节 概述
第二节 荧光团
一、有机染料分子
二、荧光蛋白
三、量子点
第三节 荧光显微镜
一、激光共聚焦扫描显微镜
二、广场落射式荧光显微镜
三、全内反射性荧光显微镜
四、双光子或多光子激光扫描显微镜
五、多光谱激光扫描显微镜
第四节 荧光显微术
一、荧光蛋白生物探测器
二、用光漂白技术来研究活细胞内蛋白质的运动和分子动力学:FRAP、iFRAP和FLIP
三、荧光共振能量转移
四、荧光寿命成像显微术
五、荧光相关光谱
六、双分子荧光互补和绿色荧光蛋白的环形重排
七、可被光激活的笼锁蛋白及发色团协助的激光失活的应用
八、荧光颗粒显微术
第五节 单分子检测技术
一、单分子成像技术
二、单分子纳米操作技术
三、单分子成像与纳米操作技术的结合
第八章 组织细胞电生理学技术
第一节 电生理技术概述
一、发展概况
二、电生理测量技术
第二节 细胞外记录技术
一、细胞外记录——根据胞外电位推断神经元活动的电生理记录
二、心电图
三、脑电图
第三节 细胞内记录技术
一、细胞内记录的设计
二、脑切片上的细胞内记录
第四节 膜片钳记录
一、膜片钳技术设计
二、离子通道的几种记录模式
三、膜片钳技术的基本操作步骤
四、研究应用与举例
第五节 RT-PCR和膜片钳技术
一、基本原理
二、应用和举例
第六节 膜片钳和钙成像技术
一、基本原理
二、设备和实验步骤
三、测定的准备工作
四、测定的实际操作
五、应用与举例
第七节 脑片的胞体、树突和轴突上的膜片钳记录
一、树突或轴突记录的确认
二、树突记录的实例
三、讨论和结论
第八节 爪蟾卵母细胞膜片钳记录技术
一、基本原理
二、实验基本操作
第九章 细胞内信号转导的研究
第一节 细胞信号转导的基本原理
一、胞外信号分子与特异性受体结合
二、胞外信号可经过长程或短程起作用
三、每个细胞应答特定的细胞外信号分子
四、相同信号分子能诱导不同靶细胞的不同反应
五、一氧化氮能直接进入靶细胞结合细胞内酶
六、主要的三类细胞表面受体
七、细胞内信号蛋白起一系列分子开关的作用
第二节 信号转导研究相关策略及技术
一、蛋白质磷酸化
二、蛋白质相互作用
第三节 信号通路举例
一、MAP kinase信号通路
二、NF-kB信号通路
第十章 动物基因修饰技术
第一节 概述
第二节 研究策略及相关技术原理
一、非定向动物基因修饰技术
二、定向动物基因修饰技术
三、相关资料库及互联网资源
第十一章 肿瘤生物标志物的筛选策略
第一节 肿瘤生物标志物的基本概念
第二节 肿瘤生物标志物的筛选策略
一、差异表达基因mRNA的筛选
二、差异表达蛋白的筛选
三、蛋白质指纹图谱技术
四、生物信息学
第三节 肿瘤生物标志物的验证
一、mRNA水平验证
二、蛋白质水平验证
第四节 肿瘤标志物的临床评价
第十二章 分子药物靶点的研究
第一节 概述
一、分子药物靶点的概念
二、分子药物靶点的研究内容
三、分子药物靶点的研究策略
第二节 分子药物靶点的研究技术原理
一、基因组学
二、蛋白质组学
三、遗传联合
四、正向遗传学
五、反向遗传学
第三节 分子靶点的确认
第十三章 干细胞实验研究
第一节 概述
一、干细胞分类
二、干细胞研究历史
第二节 干细胞研究策略
一、干细胞研究材料的获取
二、干细胞生物学
三、干细胞的应用前景
第三节 干细胞研究的相关技术原理
一、胚胎干细胞体外培养技术
二、成体干细胞的分离纯化技术
三、干细胞的鉴定技术
四、干细胞体外分化技术
五、干细胞低温保存与复苏
第十四章 网络生物信息数据库及相关软件的应用
第一节 概述
第二节 常用的数据库介绍
一、数据库存储格式
二、核酸数据库
三、蛋白质数据库
四、数据库检索方法
第三节 数据库及软件的应用举例
一、用GenScan来预测内含子、外显子及氨基酸序列
二、用ScanProsite来分析编码的氨基酸的motif
三、用BLAST来搜索序列相似蛋白质
四、用COGnitor来分析直系同源物
五、用MultAlin来进行多序列比对
六、搜索CDD数据库,找到预测蛋白的保守区域并显示此结构域的空间结构
七、小结
第四节 常用生物信息数据库及软件
一、生物信息数据库
二、常用软件和网上服务
名词索引
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第一章 基因组学
基因组学在医学研究中的核心内容是运用基因组学的新思路、新技术进行疾病基因的快速克隆， 以及高通量、系统化地揭示疾病的分子病理。
第一节 概述
一、基因组学基本概念
基因组（genome） 是指生物体单体中一套完整的遗传物质， 即全部基因的总称（包括所有的编码区和非编码区） ， 是特定物种一个细胞内全部DNA 分子的总和； 或者指当同样信息存在于多个拷贝中时， 单个拷贝的遗传物质（后者有时也被称为“单倍体基因组”） 。
真核生物99% 以上的DNA 存在于核基因组（nuclear genome） 中， 少部分存在于细胞器基因组（organelle genome） 中。例如， 人类基因组由3 × 109 个碱基对组成， 分布于22 对常染色体、2 条性染色体和1 个线粒体上。基因组具有功能性的高级结构，可以根据其理化性质和顺序进行描述。大部分生物的DNA 可简单地分为只出现一次的单一序列（unique sequence） DNA 和重复序列（repetitive sequence） DNA 。大多数基因存在于单一序列DNA 中， 但在中等重复序列DNA 中也存在与高度保守的多基因家族相对应的基因。从低等原核生物到高等真核生物， 基因组大小、复杂度、基因数目、组成、结构及基因在基因组中的组织方式都发生了显著变化（表1-1） 。细菌和一些低等真核生物基因组中绝大部分是可表达的单一DNA 序列， 基因结构复杂且排列密度高， 基因内部一般不含内含子。相反， 高等真核生物基因组大， 大部分为非编码DNA ，基因大小变化很大， 常含有多个内含子， 且内含子一般大于外显子（表1-2） 。
基因组携带了有关个体生长发育、生老病死的全部遗传信息。人类对自身遗传信息本质的研究和探索已进行了几十年， 但从20 世纪60 年代开始才真正从DNA 的组成和分子结构水平认识基因。基因组学（genomics） 一词最早于1986 年7 月由T.H.Roderick 等提出， 是包括基因组作图、测序及分析的综合学科。基因组学着眼于研究并解析生物体整个基因组的所有遗传信息， 完全不同于经典遗传学“局部和分散”
的研究方法。人类基因组学研究主要包括两个部分： ① 基因组DNA 全部序列的测定； ② 基因DNA 序列的识别及其正常功能、基因变异与功能关系的研究。已经完成的人类基因组计划（human genome project ，HGP） 是基因组研究的里程碑， 将破译蕴藏在DNA 分子中有关人类生存、繁衍和进化的全部遗传信息， 不仅有助于了解人类的正常生理功能， 还将揭示多种疾病的发病机制， 可广泛应用于疾病的诊断、治疗及预防。
二、人类基因组计划
（一） 人类基因组计划概况
人类基因组计划与曼哈顿计划、阿波罗登月计划并称为人类自然科学史上的三大工程。其主要内容是绘制人类的遗传图、物理图和序列图， 其核心是序列图的绘制。
HGP 在15 年内完成人类23 对染色体的基因组图谱的绘制和DNA 全序列分析， 获得人类认识自我的最重要的生物信息。
HGP 于20 世纪80 年代开始酝酿， 1989 年美国国会正式批准资助， 1990 年10 月1日美国能源署（DOE） 和NIH 正式启动该计划， 投资30 亿美元， 且每年追加新的资金。除美国外， 英国、法国、德国、日本、中国等国家先后加入， 使得HGP 成为一项世界范围的科研项目。HGP 原预计15 年完成， 由于实施过程中大规模测序技术及生物信息分析技术的重大突破， 项目进展超过了预期进度， 于2000 年6 月完成全基因组工作草图， 2003 年4 月完成全部目标， 比原计划提前了2 年。
（二） 人类基因组计划的成果
HGP 完成的测序部分达到全基因组的99.99% 以上， 所建立的人类基因组图谱可理解为人类的“第二张解剖图谱” 或“分子解剖图谱” ， 更为详细和全面地揭示了人类基因组信息： 人类全基因组由约31.647 亿个碱基对组成， 分布在22 对常染色体、2 条性染色体上和1 个线粒体上； 任何两个个体基因组99.9% 以上的碱基序列相同， 差异不到0.1% ； 现发现蛋白质编码基因约3 万个， 远少于先前所预测的10 万个； 各染色体含基因数量差别较大， 其中1 号染色体最多（2968 个） 、Y 染色体最少（78 个） ； 基因平均长度为3kb ， 基因长度差别很大， 已测得的最大基因是长达2.4Mb 的抗肌萎缩蛋白基因； 蛋白质编码序列仅占全基因组序列的1.5% 左右， 非编码的重复序列， 即所谓的“垃圾DNA （junk DNA）” 超过总基因组的50% ， 这些重复序列可能无直接功能， 但可能对染色体结构有动力学作用， 并可能参与基因改形、制造新基因、基因修饰或改组等， 是有待进一步研究的重要领域。
HGP 的科学意义在于：
（1） 确定基因组中的基因序列和物理位置， 为基因产物及其功能的研究奠定基础；
（2） 分析基因转录及调控元件的结构和位置， 从全基因组水平了解基因转录及调控的机制；
（3） 从整体水平了解染色体结构， 不同序列在DNA 复制、转录和调控中的作用及影响；
（4） 从三维空间角度研究基因的转录和调控；
（5） 发现与DNA 复制、重组相关的序列， 研究人类基因组的遗传与进化进程；
（6） 通过对DNA 突变、重排和染色体断裂等的研究， 了解多种疾病的分子机制；
（7） 比较和研究个体染色体间的多态性， 以用于基因诊断、个体识别、组织配型及疾病风险预测等；
（8） 确定人类染色体中转座子、逆转座子和病毒残余序列及其周围序列， 了解病毒基因组侵染人体基因组的影响， 指导基因治疗病毒载体的设计和应用。
HGP 所建立的研究策略、合作机制及技术体系奠定了人类基因组学研究的基础，可应用于微生物、植物、动物等物种的研究， 以及医学、农业、工业、环保、能源等多个领域的研究。HGP 的实施促进了生命科学与信息科学、材料科学、精密制造等多学科和技术的交叉融合， 带动了一批新技术产业的发展。
（三） 基因组研究的远景
人类基因组图谱将成为疾病预测、预防、诊断、治疗和个体医学研究的分子参照，将是21 世纪生命科学、基础医学和生物产业的基础。其研究成果将被应用于众多领域，如下所述。
（1） 分子医学： 疾病的基因诊断、疾病遗传易感性分析及风险预测、新药开发、基因治疗、个体化药物设计等。
（2） 微生物基因组研究： 快速诊断及治疗临床病原微生物、开发新能源、监测环境污染、防止生物武器、清除有毒废弃物等。
（3） 职业风险评估： 某些接触放射性或有毒物质的特殊职业人员的风险评估。
（4） 生物考古学（bioarchaeology ） 、人类学（authropology ） 、进化及人类迁移分析。
（5） 法医学DNA 鉴定。
（6） 农业、畜牧业及生物工艺： 抗病、抗虫、抗旱新作物， 健康、高产、抗病家禽、家畜， 高营养产品， 生物杀虫剂， 食物疫苗， 清洁或保护环境的植物等。
HGP 的完成仅仅是第一步， 只是以测序为主的“结构基因组学” ， 对人类遗传信息的解读和开发利用才是最终目标， 此即“后基因组计划” 的任务， 也就是对基因组的功能进行探索和利用。在HPG 完成后， 科学家相继提出了药物基因组学、环境基因组学、蛋白质组学等新的学科， 并组织和实施了一系列旨在开发和利用基因组信息的新研究计划。例如， 美国的“人类癌症基因组计划” 投资13.5 亿美元， 建立了超过12 500个肿瘤标本的基因库， 并将肿瘤患者和正常人的基因组进行比对分析， 计划为50 种常见肿瘤绘制250 幅基因图谱， 编制所有致癌突变目录， 此计划规模相当于HGP 的100 倍。
美国能源署（DOE） 提出的基因组与生命科学计划（genomes to life ， GTL） ， 通过分析微生物和植物群体在自然环境中的功能特性、重要功能蛋白质的作用及其基因调节和控制， 来模仿复杂的生物系统。预期各阶段目标为： 10 年内掌握微生物清洁体系的基础知识， 到2020 年在废物和有毒物处理方面节省数十亿美元； 到2040 年了解地球自然碳循环并设计增加碳捕获能力的策略， 帮助稳定大气层CO2 ， 应对和遏制全球变暖； 到2050 年开发出生物燃料和生物电资源， 形成生物能源工业（biohydrogen-based industry） ， 为美国能源安全作出贡献。
第二节 研究策略及基本原理
一、遗传或连锁图谱遗传图（genetic map） 又称为连锁图（linkage map） ， 它用遗传学方法确定基因或DNA 标志在染色体上的相对位置与遗传距离。遗传距离常用基因或DNA 片段在染色体交换过程中的分离频率来表示， 单位为厘摩（cM ） ， 1cM 代表1% 的交换率。cM 值越大， 两者间的遗传距离越远。
（一） 遗传作图的标记
理想的分子标记应满足以下要求： ① 具有较高的多态性； ② 共显性遗传， 即利用分子标记可鉴别二倍体中杂合和纯合基因型； 能明确辨别等位基因； ③ 除特殊位点的标记外， 分子标记均匀分布于整个基因组； ④ 检测手段简单、快速， 实验程序易实现自动化， 开发成本和使用成本尽量低廉； ⑤ 在实验室内和实验室间重复性好， 方便进行数据交换。
经典遗传作图标记包括形态学标记、细胞学标记、生化标记等。由于此类标记依赖于蛋白质表达， 只能间接反映基因组信息， 存在多个基因共同影响同一表型、数量及分布有限、标记数量小、特殊遗传材料培育困难等问题， 因此在20 世纪80 年代后逐渐被DNA 遗传标记所取代。这里主要介绍DNA 标记。
1.第一代DNA 标记
20 世纪80 年代， David Bostein 等提出了限制性片段长度多态性（restriction fragmentlength polymorphism ，RFLP） 。其基本原理是： 由于DNA 序列差异导致限制性内切核酸酶识别位点的丢失或新增， 用限制性内切核酸酶处理后可产生长度不同的限制性酶切片段， 从而直接显示不同个体在基因组同一位点DNA 组成的差异。限制性内切核酸酶专一性识别碱基序列， 不同限制性内切核酸酶处理同一DNA 样品可产生相应的不同DNA 片段， 因此可提供大量的位点多态性信息。RFLP 是第一种用于遗传作图的DNA 标记， 其优点包括： ① 在染色体上位置相对固定； ② 同一亲本及其子代在相同位点的多态性特征一致； ③ 共显性特征； ④ 同一电泳可显示不同多态性片段。RFLP 的主要局限性是多样性低、操作费时、需要大量高质量的DNA 模板等。
2.第二代DNA 标记
简单序列长度多态性（simple sequence length polymorphism ，SSLP） 是指基因组中重复序列的可变性排列， 由于重复次数不同而表现为DNA 序列的长度变化。SSLP主要包括： ① 小卫星序列（minisatellite） ， 又称可变串联重复（variable number of tan-dem repeat ，VNTR） ， 重复单位长度一般为15 ～ 65bp ； ② 微卫星序列（microsatellite）或简单串联重复（simple tandem repeat ，STR） ， 重复单位长度为1 ～ 6bp ， 重复次数为10 ～ 60 次。由于STR 在整个基因组中分布更广、密度更高， 且便于进行PCR 分析，因此较VNTR 应用更为普遍。人类基因组作图应用最多的STR 为AG ， 主要分布在5′和3′非翻译区及内含子中。
SSLP 可用酶切后电泳、特异性探针杂交， 或采用PCR 扩增后直接电泳观察产物条带的迁移率变化进行判断。
3.第三代DNA 标记
单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism ，SNP） 是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA 序列多态性， 即基因组内特定核苷酸位置上存在两种不同的碱基， 其中最少一种在群体中的频率不小于1% 。它是人类可遗传的变异中最常见的一种， 占所有已知多态性的90% 以上。SNP 所表现的多态性只涉及单个碱基的变异， 可由单个碱基的转换（transition） 或颠换（transversion） 所致。理论上讲， SNP既可能是二等位多态性， 也可能是三或四等位多态性， 但实际上后两者非常少见， 几乎可以忽略。因此， 通常大部分SNP 都是二等位多态性。SNP 作为一种碱基的替换， 大多数为转换， 颠换较少， 转换与颠换之比大约为2 ∶ 1 。换句话说， 转换型SNP 约占23 ，颠换型约为13 。
SNP 作为分子标记具有以下优势。
（1） 数量多，分布广泛。人类基因组平均每100 ～ 300 个核苷酸就有一个SNP ， 人类基因组30 亿个碱基中共有1000 万～ 3000 万个SNP ，至少93% 的人类基因都存在SNP 。
（2） 适于快速、规模化筛查。SNP 通常为二态性标记， 即二等位基因（biallelic） 。
在基因组筛选中SNP 往往只需+ - 的分析， 易于进行自动化筛选或检测。
（3） 突变率低， 稳定性好。与串联重复的微卫星序列相比， SNP 高度稳定， 而前者的高突变率容易引起对人群的遗传分析出现困难， 尤其是处于编码区的cSNP 。
（4） 可直接作为疾病分析遗传标记。部分位于基因内部的SNP 可能会直接影响产物蛋白质的结构或表达水平。SNP 本身可能就是疾病遗传机制的候选位点。
SNP 自身的特性决定了它比其他两类多态标记（RFLP 和SSLP） 更适合于对复杂性状疾病的遗传解剖和基于群体的基因识别等方面的研究， 它是目前最为理想的DNA标记。
（二） 遗传作图方法
遗传作图（genetic mapping） 的基础是孟德尔的遗传学原理及Bateson 和Punnett建立的连锁分析方法。细胞减数分裂过程中， 每条同源染色体复制后并非立即分开， 而是彼此靠近， 同源区段并排形成二价体， 此时并列的同源染色体臂之间发生机械断裂，彼此交换DNA 区段， 此过程称为交换（crossing-over） 或重组（recombination） 。假如交换随机发生， 两个相互邻近基因因交换而分离的频率低于距离较远的两个基因； 换言
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