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| 內容簡介： |
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本书从反向遗传学角度关注昆虫病原真菌的开发利用及其作用机制。第一章主要介绍农业害虫病原真菌的研究背景和概况。理论上，所有的昆虫都易受病原真菌感染而致病，故当昆虫病原真菌传播和扩散时，就会造成昆虫群体感染而大面积死亡。当前，环境问题日益突出，因施用化学农药而造成的健康问题更是引人注目，于是开发可替代化学农药或者补充性的生物农药以保护环境，并提供绿色的、健康的食品显得非常重要。利用昆虫病原真菌控制农业有害昆虫，实施生物控制和病虫害综合治理（IPM）是造就绿色环境的重要途径。在昆虫病原真菌的生活史中，首先是孢子遇到昆虫后通过分泌的黏液附着到昆虫体表，同时孢子膨大，萌发产生芽管。芽管在昆虫体表找到合适的位点后开始进行穿透。然后芽管的顶端开始膨大产生附着胞，附着胞进而产生穿透钉，穿透钉透过表皮进入昆虫血腔，进入血腔后，菌丝由丝状转变为酵母状的虫菌体，虫菌体以血腔中的血液为营养基迅速繁殖生长。昆虫死亡后，病原真菌从血腔内穿透皮层再次产生分散的孢子进入下一个周期。前人对昆虫病原真菌侵染机制的研究主要集中在毒力基因的作用机制上，而对其他基因的作用机制探索甚少。本书第二章针对基因编辑技术的详细操作和结果分析做介绍，能够促使研究者很快进入实验室，实现基因功能的研究。这些技术是目前从事基因功能研究的必要手段，是从事该领域的科技工作者必须熟练掌握的技能。第三章的内容背景是当今生物基因DNA的测序数据总量在以指数级速度增长，如何对数据库中海量数据进行科学搜集、管理、挖掘、注释，已成为基因组学与蛋白质组学研究的热点。为普及和提高我国基因功能研究者掌握生物信息学科知识，学习掌握序列数据分析的实用操作技能，及时了解该领域的最新进展，本章介绍了基因功能研究领域的具体应用实例。主要学习数据库搜索与常用工具的操作应用，采用“一步一图”的方式，边介绍边示范，读者可以备上电脑，跟着本书的说明一步步操作，可在较短时间内掌握基本操作程序。为满足读者的需要，根据科学研究近期发展，本书新增了一些软件的操作数据、蛋白质数据和基因相关的结构显示与分析等内容。经过学习可以初步掌握上述方法，应用于自己的课题，可以快节奏、高效率地开展自己的研究工作。有助于读者在研究过程中打开眼界，增长见识，产生协作研究和学习的愿望。第四章在基因敲除的基础上研究基因β-tubulin和MaPpt1在病原真菌的作用机制。β-tubulin是组成微管的基本单元之一，微管又是构成细胞骨架的亚细胞结构成分。β-tubulin参与多种细胞生物学过程。在本书中探讨单一的β-tubulin基因对蝗绿僵菌的细胞形态、产孢和毒力的影响。敲除β-tubulin基因后，细胞核、脂滴和几丁质被运输到细胞壁的能力下降。β-tubulin基因的缺失导致菌丝弯曲和菌落密实聚集的形态。敲除β-tubulin基因后孢子梗的形成率和产孢量也显著下降。敲除β-tubulin基因使其侵染蝗虫的能力显著下降。侵染结构的形态分析表明：缺失β-tubulin基因会产生二叉型芽管，促使附着胞的形成率下降；尼罗红染色显示附着胞内的脂滴分布下降；PEG 800试验表明附着胞的膨压下降。在蝗虫活体内和在试管内蝗虫体液培养的β-tubulin基因缺失菌株再生能力都显著下降。综上所述，表明β-tubulin相关的微管运输功能在蝗绿僵菌的细胞形态、产孢和毒力方面是必需的。第五章介绍关于敲除丝状真菌蝗绿僵菌Ppt1/PP5基因的研究。其产孢进程从气生分生孢子到微循环产孢发生改变。虽然总体生长没有明显变化，但是突变体的菌落形态发生显著性改变。Mappt1突变菌株的热击反应和毒力没有变化，而其抗紫外的能力却显著提高。eGFP-MaPpt1蛋白的融合表达表明它定位在孢子的细胞质中，但是在生长的菌丝中定位在隔上。MaPpt1（Mappt1 vs野生型）的可能靶标通过磷酸化蛋白质组学被进一步证实。差异化基因（Mappt1 vs野生型）表达揭示了包括糖异生作用、核酸、脂肪酸和细胞信号网络的代谢过程。这些数据为MaPpt1在丝状真菌生长和分化方面的独特功能提供了科学依据。第六章对本书主要内容进行总结与展望。本人在编写过程中，对全部文字和图表进行认真修正和统一处理，以使全书文笔流畅连贯。为便于研究者在计算机上操作，还在相应的图表中做注释和符号标记。但是书中的错误和缺点仍在所难免，恳请读者指正。本书的编写得到周口师范学院的大力支持、鼓励和热忱推荐！期待本书的出版发行，能在宣传基因功能研究、普及生物学知识、培养年轻科学人才等方面做出应有的贡献。
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| 目錄：
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第一章导论
11研究背景
12研究现状
121真菌侵染过程的研究
122真菌产生代谢物的研究
123侵染后的宿主防御研究
124相互作用的三级程度研究
125被侵染的昆虫致死性行为变化研究
126昆虫病原菌的传播方式研究
127昆虫宿主-病原菌模型的遗传多样性研究现状
128昆虫病原真菌的流行病学研究
129建模
1210控制潜力
1211毒力基因与非毒力基因
13研究技术路线
第二章基因功能的实验研究过程
21载体结构
22质粒的扩大培养与提取（以天根质粒提取试剂盒为例）
23质粒酶切
24回收酶切质粒（OMEGA凝胶回收试剂盒）
25目的基因的寻找与电子PCR
26酶切位点分析
27引物设计和接头添加
28PCR扩增
29上样电泳
210PCR产物回收
211酶切质粒回收物和PCR纯化产物的连接
212感受态大肠杆菌转化
213阳性克隆鉴定
214靶基因的下游片段重组
215重组完整的质粒电转到农杆菌
216农杆菌侵染目标真菌
217真菌转化子培养与PCR验证
2171真菌转化子培养与PCR验证过程
2172微量DNA提取试剂配方
218真菌转化子的Southern Blotting杂交验证
2181真菌基因组DNA提取
2182Southern Blotting杂交操作
第三章基因功能的生物信息学研究
31Motif的分析与再现
311序列下载
312Motif分析
313Motif分析再现
314MEME的应用
32Motif的批量分析方法
321文件准备
322导入数据与设置
323细节调整与文件保存
324空间位置大小调节
325文本设置
326其他
33多基因组比对和共线性分析Mauve软件
34蛋白质三维结构预测（SWISS-MODEL）
35同源性分析—进化树构建
351Mega软件构建进化树
352clustalx与Mega联合构建进化树
353在线比对与Mega联合构建进化树
354构建系统发育树需要注意的问题
355系统发育树的美化
36小RNA分析方法
361数据下载
362mRNA差异表达
363lncRNA差异表达
364miRNA差异表达
365ceRNA网络构建
37基因编码蛋白的二级结构预测
371PSIPRED Workbench在线预测
372COILS在线预测卷曲结构
373Jpred4在线预测
374scratchproteomics在线预测
375Predict Protein在线预测
376信号肽的在线预测
38蛋白质的物理化学性质预测
39基因的模体识别与解析
310蛋白结构的可视化
311基因的富集信号通路分析
312分子对接分析
3121分子对接的基础
3122Chimera软件分子对接过程
3123分子对接细节展示
3124分子对接结果平面化
313蛋白活性口袋的预测
314antiSMASH数据库—微生物次生代谢物合成基因簇查询和
预测
315蛋白的多级构比对分析
316Circos在线绘图
第四章蝗绿僵菌微管蛋白（β-tubulin）基因的功能
41研究背景
42研究的内容
43实验材料
431主要仪器设备
432主要试剂和培养基
44实验方法
441菌株和培养条件
442生物信息学分析
443真菌基因组DNA和RNA提取
444荧光染色及观察
445Southern blotting
446载体构建及转化子的获得
447孢子和虫菌体的计数
448产孢量的测定
449昆虫生测
4410PCR扩增程序和条件
4411数据处理
45结果分析
451蝗绿僵菌β-tubulin基因的生物信息学分析
452蝗绿僵菌目标基因β-tubulin基因敲除和回复转化子的
验证
453蝗绿僵菌β-tubulin基因对菌落形态和菌丝形态的
影响
454蝗绿僵菌β-tubulin基因对毒力的影响
455蝗绿僵菌β-tubulin基因对产孢的影响
456蝗绿僵菌β-tubulin基因对侵染结构附着胞的影响
457蝗绿僵菌β-tubulin基因在细胞核事件中的功能
46讨论
第五章蝗绿僵菌MaPpt1负调控微循环产孢和紫外抗性
51研究背景
52研究内容和技术路线
521研究内容
522研究技术路线
53实验材料
531主要仪器设备
532主要试剂和培养基
54实验方法
541菌株和培养条件
542生物信息学分析
543真菌基因组DNA和RNA提取
544荧光染色及观察
545Southern blotting
546载体构建及转化子的获得
547孢子和虫菌体的计数
548产孢量的测定
549昆虫生测
5410RNA的提取和定量分析
5411磷酸化蛋白质组学分析
5412数据处理
55结果分析
551蝗绿僵菌MaPpt1基因的生物信息学分析
552蝗绿僵菌MaPpt1目标基因的敲除和回复菌株的
构建
553蝗绿僵菌MaPpt1对菌落表型的影响
554蝗绿僵菌MaPpt1对产孢量的影响
555蝗绿僵菌MaPpt1对紫外逆境抗性的影响
556蝗绿僵菌中MaPpt1在湿热逆境中的作用和表达模式的
分析
557MaPpt1在紫外和湿热逆境中的作用
558蝗绿僵菌MaPpt1在不同培养基上对产孢的影响
559蝗绿僵菌MaPpt1对毒力的影响
5510蝗绿僵菌MaPpt1调控的信号途径材料的选择及RNA
质量评估
5511蝗绿僵菌MaPpt1 基因的敲除改变了产孢的信号
途径
5512蛋白质组学分析MaPpt1在产孢和UV抗性的作用
机制
5513MaPpt1调控的基因网络
56讨论
第六章主要结论与展望
附录
AqRT-PCR数字表达谱验证结果
B蛋白质组学分析结果
C蛋白质组学质谱图
D缩略词
E常用色素配制及使用方法
F常用抗生素配制及使用方法
G常用培养基
H常用试剂配制方法
I常用酸碱指示剂及变化范围
J常用生物鉴定引物
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